특정미생물 5종 시험법 in 색조화장품
특정균 > 검출 > 전량 폐기
◆ 특정 미생물 5종 시험 방법의 흐름~
1. 샘플 전처리
시료 1g을 취해 희석액(D/E broth(▷녹농균, 황색포도상구균, 대장균, 살모넬라) 또는 SDB(▷칸디다알비칸스))에 9 g 첨가 → 10배 희석
각각 조건에 맞게 배양(32.5℃)
녹농균, 황색포도상구균, 대장균, 살모넬라는 24시간, 칸디다는 3~5일이지만 보통 3일 합니다
(D/E broth-Dey/Engley Neutralizing Broth)
칸디다만 SDB를 사용하는 이유는 효모의 특성에 맞춰 낮은 pH에서 증식이 잘 되는 SDB를 사용합니다!
총 생균수 측정과 달리 특정균 시험에서는 배양(Enrichment) 과정이 이루어집니다. 균을 증폭하고 선택적으로 골라내기 위함입니다.
2. 시험균별 확인 방법
(1) Pseudomonas aeruginosa (녹농균)
배지: Cetrimide Agar
조건: 24시간, 32.5℃
판정: 청록색 집락 → 양성 확인
(2) Staphylococcus aureus (황색포도상구균)
배지: Mannitol Salt Agar
조건: 24시간, 32.5℃
판정: 노란색 집락 → 양성 확인
(3) Escherichia coli (대장균)
배양 단계:
3-1) MacConkey Broth (24h, 32.5℃)
3-2) 이어서 MacConkey Agar 접종
판정: 붉은색 집락 → 양성 확인
(4) Salmonella (살모넬라)
배양 단계:
4-1) Rappaport-Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth (24h, 32.5℃)
4-2) 이어서 XLD Agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar) 접종
판정: 흑점(황화수소생성)이 있는 붉은색 집락 → 양성 확인
(5) Candida albicans (칸디다 알비칸스)
배지:SDA (Sabouraud Dextrose Agar)
조건: 24시간, 32.5℃ (48시간 보는 것이 좋습니다)
판정: 크림색 집락 → 양성 확인
♣ 여기서 잠깐! ①
식약처, ISO, EP, FDA 규정별 시험방법이 다를 수 있습니다, 수출 대상국의 규정에 따른 시험법을 정확히 확인해야 합니다. 1차 배양조건은 거의 동일하나 2차 배양의 경우 예를 들면, 황색포도상구균의 분리배양 시 MSA(Mannitol Salt Agar)를 사용할 경우 노란색 집락, BPA(Baird-Parker Agar)를 사용하면 투명대(2~5mm)로 둘러싸인 광택 흑색이 나타납니다. 그리고 배지 배양시간도 규정마다 차이가 있습니다 24시간, 24~48시간, 18~72시간, 3~5 일등.. 생산일정에 맞춰야 되는 현실적인 부분을 고려해서 세균배양은 24시간으로, 진균 1차 배양은 3일로 합니다. 일반적으로는 ISO 시험법을 따릅니다. 국제 표주기구 공인시험법이어서 보편성이 높고 증균 배양배지의 선택 폭이 널고 중화 희석 배지를 사용함에 있어서 유리하다고 합니다. 그리고 다른 배지를 사용할 경우는 시험법의 적합성시험을 꼭 거쳐야 합니다. 미생물 시험법의 경우 매뉴얼이 잘 되어있어서 다행이지만, 시험법의 적합성 시험이 잘 안 나오면 희석배지부터 시작해서 확인해야 하는 경우가 많습니다. 색조화장품의 경우 특히, 방부제를 사용하다 보니 가끔 적합성시험에서 어려움을 겪는 경우가 간혹 있습니다
황색포도당구균 2차 배지 종류에 따른 반응차이
▶ Mannitol Salt Agar (MSA) →
황색포도상구균이 Mannitol을 분해하면서 산을 생성 → 배지 색이 노란색으로 변함
→ 노란색 집락 + 황변 된 주변부 → 양성
▶Baird-Parker Agar (BPA) →
황색포도상구균이 Tellurite를 환원 → 광택 있는 흑색 집락 형성~ 동시에 Lecithinase 활성으로 투명한 halo(2~5mm) 형성→ 검은색 집락+투명대 → 양성
즉, MSA는 탄수화물 대사(산 생성) 기반, BPA는 단백질 분해(lecithinase) + 환원 반응 이 발생합니다
♣ 여기서 잠깐!②
칸디다는 다른 4종의 균과 다르게 1차 배양 시 SDB배지를 사용합니다 칸디다는 세균이 아닌 곰팡이(효모)의 일종입니다.
> SDB의 특징: 높은 당(Dextrose) 성분과 낮은 pH(산성 환경, 약 5.6)를 가지고 있습니다.
> 사용 이유: 대부분의 세균은 낮은 pH에서 성장이 억제되지만, 칸디다 같은 곰팡이 및 효모는 낮은 pH에서 아주 잘 자랍니다. 따라서 SDB는 칸디다의 증식에 최적화된 선택 배지 역할을 동시에 수행합니다.
> 칸디다 시험에서는 '중화'도 중요하지만, 칸디다의 선택적인 '증식'을 유도하는 환경이 더 중요하기 때문에 SDB를 사용하며, 필요한 경우 SDB에도 중화 성분(예: Tween 80)을 추가하여 사용합니다.
> 배양온도 32.5℃ (총호기성생균수 진균 측정 시에는 22.5℃)
> SDB 배양 시 뚜껑을 너무 꽉 닫으면 응결수로 오염 가능성↑
♣ 여기서 잠깐!③
그러나 특정균시험 시에는 가급적 Tw80도 사용하지 않습니다
◆ 생균수 측정 시 Tw80을 사용하는 이유
- Tw80 (Tween 80)은 비이온성 계면활성제로, 시료 내에 존재하는 미생물을 고르게 분산시키는 데 도움!
- 립스틱이나 액상 파운데이션처럼 기름 성분이 많은 화장품에서는 미생물이 유상층에 갇혀 있을 수 있어 Tw80을 넣어야 균이 수용성 희석액으로 잘 풀려나와 생균수 측정이 정확해집니다.
- 또한, Tw80은 균을 배지에 고르게 퍼뜨리는 데 유리하여 colony count의 정확도를 높입니다.
◆ 특정균 1차 배양 시 Tw80을 넣지 않는 이유
- 1차 배양은 균을 증식시키는 과정으로, 균이 자라기 좋은 환경을 제공해야 합니다.
- 일부 균주에 대해 성장억제효과를 나타낼 수 있으며, 배지의 영양성분을 변화~ 균의 생육에 영향을 줄 가능성↑
- 특히 특정균을 선택적으로 배양할 경우, 불필요한 첨가물인 Tw80은 배제.
- 항균제나 방부제 시험에서는 보조제로 쓰일 수 있지만, 균 증식 목적의 배양에서는 오히려 배양 결과를 왜곡! 할 수 있는 우려가 있어 사용하지 않습니다
특정균 5종과 총호기성생균수 시험을 [월~화~수~목~금~토~] 요일을 따라 위의 표와 같이 정리해 둔 것은 특정균시험을 하고 출하되는 제품은 최소 5일의 시험시간이 필요해서입니다. 그리고 연속작업 1차, 2차, 3차 배양이 필요하기 때문에 가급적 매주 월요일은 시험이 시작되어야 합니다. 제조는 최소 지난주 금요일에 마무리가 되어야겠지요! 왜 날짜이야기를 하냐면 품질부서(미생물팀)에게 아무 요일에 시험의뢰하면 1. 화를 낸다. 2. 어쩔 수 없다면 주말약속은 취소되어야 되기 때문입니다. 생균수측정 시 진균의 경우는 도말해 놓으면 5일이지만 7일까지 봐도 됩니다. 그리고 연속작업이 없어서 도말만 해놓으면 일은 항온조가 알아서 해주거든요! 이 약속이 지켜져야 워라밸이 가능합니다. 특정균시험을 아무 요일이나 요구하면 부서 간의 협업의 선은 끊어집니다. 그리고 균실험에는 시간, 비용, 장비 등도 투자가 되어야 합니다.
예를 들면, HEPA필터가 있는 Fume Hood, Vortex Mixer, incubator, autoclave, Stomacher(교반), 피펫 등 기기분석에 비할바는 아니지만, 배지는 당연히 사야 하고요. 무엇보다도 꼼꼼한 QC가 있어야 합니다. 미생물팀은 제품의 균뿐 아니라, 환경평가(부유균, 부착균), 정제수의 균확인(PCA+00ml Filter Paper)도 합니다. 그리고 실험 후 배지는 고압멸균기를 사용하여 안전하게 폐기해야 합니다. 모든 부서가 바쁘지만 미생물팀도 할 일이 참 많습니다. 당연하지만 제품에서 미생물오염이슈가 발생되면 모든 부서에 비상이 걸립니다. 하나씩 하나씩 원인파악해서 해결됩니다만, 시간이 촉박하다 보니 해결되기 전까지는 좌불안석일 수밖에 없습니다.
특정균에 대한 설명은 OJT교육 중 습득한 정보를 공유하는 것으로 마무리하겠습니다
생균수 측정은 단순히 “얼마나 많은 균이 있는가”를 보는 것입니다. 그래서 희석 후 바로 도말해서 콜로니 수를 세면 됩니다만 특정균시험은 “이 제품에 위험한 균이 있는가?”를 확인하는 거라서, 그 균만 잘 자라게 하는 환경을 만들어줘야 합니다 그래서 예비배양 → 선택배양 → 분리배양 → 확인시험이라는 단계가 필요합니다.
다시 말해서
총 생균수 측정과 달리 특정균 시험에서 배양(Enrichment) 과정을 거칩니다. 이유는 크게 두 가지입니다.
1. 극소량의 위험 균을 '증폭'시키기 위해서 (Sensitivity)
제조 공정은 대부분 깨끗하지만, 만약 살모넬라나 녹농균 같은 위험한 특정균이 아주 소량만 제품에 오염되어 있다면, 총 생균수 측정 방식(희석 후 바로 도말)으로는 그 균을 찾아내기가 어렵습니다
> 배양 과정: 시료를 특정균이 잘 자랄 수 있는 액체 배지(먹이)에 넣고 충분한 시간(보통 18~48시간) 동안 키웁니다. 이렇게 하면 원래는 너무 적어서 검출되지 않던 극소량의 특정균이라도 수를 폭발적으로 늘려서 나중에 검출할 수 있게 됩니다. 즉, 검사의 민감도를 높이는 과정!
2. 특정 균만 선택적으로 '골라내기' 위해서 (Selectivity)
특정균 5종 외에도 제조 과정에서 들어간 무해한 미생물(총생균수에 포함되는 균들)이 소량 존재할 수 있습니다
> 배양 과정: 특정균 시험에 사용하는 액체 배지는 해당 특정균(예: 살모넬라)만 선택적으로 잘 자라게 하고, 다른 일반적인 균들의 성장은 억제하는 성분을 포함하고 있습니다. 이 과정을 통해 우리가 찾고자 하는 위험한 특정균만 미리 '선별'하고 '활성화'시키는 효과가 있습니다. 즉 소량의 유해균도 검출 가능하게 만들어 줘야 합니다
'특정균'은 화장품 안전기준에서 "절대 검출되면 안 됨"이라고 정해 놓은 위험한 균들입니다
국내화장품기준에서는 녹농균, 황색포도당구균, 대장균이지만 수출할 때 나라마다 요구하는 확인실험이 차이가 나는 경우 있어서 꼭 확인해야 합니다. 그러나 일반적으로 녹농균, 황색포도상구균, 대장균, 살모넬라, 칸디다 5종의 시험범만 숙지하면 된다고 합니다
그런데요 특정균 5종이 화장품에 검출되는 경우는 거의 본 적이, 경험한 적이 없다고 합니다. 특정균까지 확인하는 공정이라면 당연히 CGMP인증을 받았거나 GMP에 준하는 시설을 갖추었기에 특정균 오염의 가능성이 낮고, 또한 화장품이 특별한 제형을 제외하고는 일정량의 방부제 혹은 방부역할을 하는 성분을 가지고 있기도 하기 때문이라고 합니다. 그리고 만약에 혹시 특정균이 발견되면 한도기준의 관리차원이 아니라 1개라도 확인되면("불검출"이 기준) 모두 전량 폐기대상입니다. 소비자 손에 들어가는 일은 없다고 합니다. 검출되면 동정실험을 포함한 원인규명이 이루어집니다. 미생물팀에서도 경험하신 분들이 거의 없다고 하네요.
립스틱과 특정균 5종의 관계
1. 살모넬라 (Salmonella)
♧ 어떤 균인가요? 주로 식중독을 일으키는 것으로 유명한 균이에요. 계란이나 육류에서 많이 들어봤을 거예요.
♣ 왜 검사하나요? 화장품 제조 과정에서 비위생적인 환경이나 오염된 원료를 통해 들어올 수 있어요. 만약 립스틱에 있다면, 입술 주변이나 구강으로 들어가 위장 질환을 일으킬 위험이 있어요.
2. 대장균 (Escherichia coli, E. coli)
♧ 어떤 균인가요? 사람이나 동물의 장 속에 살고 있는 균이에요. 대부분의 대장균은 해롭지 않지만, 일부 병원성 대장균은 심각한 설사나 복통을 유발해요.
♣ 왜 검사하나요? 대장균이 검출되었다는 건 위생 상태가 매우 불량했다는 강력한 증거예요. 제조 과정 중 오염(예: 사람의 손이나 오염된 물)이 있었다는 것을 의미하며, 다른 나쁜 균들도 함께 있을 가능성이 높아요.
3. 포도상구균 (Staphylococcus aureus)
♧ 어떤 균인가요? 우리 피부나 코 속에 흔히 사는 균이에요. 하지만 면역력이 약해지거나 상처가 있을 때 침투하면, 피부 감염(농가진, 종기), 식중독, 심지어 더 심각한 염증을 일으킬 수 있는 '기회 감염균'이에요.
♣왜 검사하나요? 립스틱을 통해 이 균이 입술 주변이나 상처에 닿으면 피부 감염을 일으킬 위험이 커지기 때문이에요.
4. 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)
♧ 어떤 균인가요? 습기가 많은 환경, 특히 물이나 토양에서 잘 자라는 균이에요. 소독제에도 잘 견디는 끈질 생명력을 가지고 있어요.
♣ 왜 검사하나요? 이 균은 특히 면역력이 약한 사람에게 눈 감염(각막염)이나 다른 심각한 감염을 일으킬 수 있어요. 립스틱에 오염되면 피부나 눈 주위에 접촉했을 때 큰 문제가 될 수 있어 철저히 검사해요.
5. 칸디다 (Candida albicans)
♧ 어떤 균인가요? 효모(곰팡이의 일종)예요. 평소에도 우리 몸의 구강, 소화기관 등에 살지만, 과도하게 증식하면 곰팡이성 감염(칸디다증)을 일으켜요. 입가에 백태가 끼거나 염증을 일으키기도 해요.
♣ 왜 검사하나요? 립스틱은 수분이나 유기물이 포함되어 있어 칸디다가 자라기 좋은 환경이 될 수 있어요. 입술에 바르는 제품인 만큼, 구강 내 감염 위험을 막기 위해 검사해요.
총호기성생균수시험법과 특정균 4종 시험법에 대한 교육을 받았고 교육내용을 정리해서 위와 같이 보고했습니다. 교육받는 동안 여러 의문과 질문이 생겼습니다. 다만 미생물전공자가 아니다 보니 100% 이해하기 어려운 부분이 있는 것도 사실입니다. 일단 의문점은 1) D/E Neutralizing Broth 가 뭐지, 2) 정제수실험의 PCA membrane filter 법이 뭐지 3) 동정실험? 4) 부착균, 부유균 실험은 어떻게 하지? 5) 고압멸균기 사용조건이 있다던데? 6) 총호기성생균수 측정 시 진균시험온도조건은 22.5℃, 칸디다알비칸스 특정균시험할 때는 32.5℃에서 진행하는데 그 이유는? 등등 여러 의문점이 생깁니다. 그래서 질문했지요! 그런데 바쁘시다고 메일로 물어보라네요. 그럼에도 감사의 말씀을 드리고 미생물팀에서의 교육은 마무리되었습니다. 질문은 Q&A형식으로 메일로 잘 정리해 보내고 답을 받기로 약속받았습니다. 미생물 관련 궁금한 내용 잘 정리해서 물어본 후 답이 오면 바로 알려드리겠습니다. 다음은 피부과학팀이나 향료팀으로 갑니다~
