“숙성육의 맛에 관한 연구 — 대사물의 시공간적변화

“숙성육의 맛에 관한 연구 — 대사물의 시공간적(時空間的) 변화”

저자:
에노모토 모토히로 (榎 元 廣 文)
소속:
테이쿄대학교 이공학부 바이오사이언스학과

目　　的

가축의 근육은 사후 강직이 일어나기 때문에, 숙성을 통해 이를 해소한 후 식육으로 출하된다. 숙성은 축육을 저온 상태에서 일정 기간 저장함으로써 이루어지며, 육질이 부드러워지고 맛이 향상되는 것으로 알려져 있다.

숙성에 의해 식육의 맛이 향상되는 원인으로는, 주요 대사산물인 단백질 유래의 감칠맛 펩타이드나 아미노산의 증가 및 축적, 그리고 글루타민산과 함께 감칠맛을 시너지적으로 증강시키는 핵산 유래의 이노신산의 존재 등이 거론되고 있다. 또한, 지질 역시 식육 내 주요 대사산물 중 하나이며, 그 맛에 있어 중요한 성분으로 여겨지고 있다.

이처럼 숙성육의 맛에는 다양한 대사산물이 관여한다고 생각되지만, 숙성에 의한 육질 향상에 있어 지질이 어떤 역할을 하는지는 아직 충분히 밝혀지지 않았다.

가스크로마토그래프-질량분석기(GC-MS)나 고속액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS) 등의 기존 분석법은 식육 내 대사산물의 정성·정량 분석에는 유효하지만, 추출 처리가 필요하므로 대사산물의 위치 정보를 상실하게 된다. 그러나 대사산물의 위치 정보를 분석하는 일도 숙성육의 맛을 결정짓는 대사산물을 밝혀내는 데 있어 중요하다고 판단된다.

질량현미경법은 조직 절편 상을 2차원적으로 질량 분석함으로써 조직 내 대사산물을 시각화하는 방법이다. 항체나 염색 등의 처리를 필요로 하지 않으며, 한 번의 측정으로 여러 대사산물을 시각화할 수 있다. 또한 이 기법은 조직 절편을 다단계 질량분석(MS/MS)하는 방식으로, 이미 여러 농림수산물에 적용된 예도 보고되고 있다.

이에 본 연구에서는 숙성에 따른 식육 내 지질의 공간적 변화를 밝히는 것을 목적으로 하여, 숙성 전후의 돼지 등심육을 질량현미경법으로 분석하였다.

방법

시약류
슬라이드 글라스(Fisherbrand Superfrost Plus microscope slides)는 Thermo Fisher Scientific 주식회사에서 구입하였다.
2,5-디하이드록시벤조산(DHB)은 Bruker Daltonics 주식회사에서 구입하였다. 그 외의 유기용매 등 시약류는 모두 분석용 고순도 제품을 사용하였다.

식육의 숙성
지역 정육점에서 도축 3일 후의 돼지 등심육을 구입하여, 수 cm³ 크기의 블록으로 절단하였다. 이 중 일부 블록은 액체질소에서 급속 동결한 뒤, -80℃의 냉동고에서 실험에 사용될 때까지 보관하였다(도축 후 3일 시료). 나머지 블록은 프리저백에 넣어 밀봉한 후, 4℃의 냉장고에서 7일간(도축 후 10일까지) 숙성시켰다. 그 후 액체질소에서 동결하여, 실험에 사용될 때까지 -80℃ 냉동고에서 보관하였다.

질량현미경 분석

크라이오스타트(CM1850, Leica Microsystems)를 사용하여, 동결된 돼지 등심육의 10μm 두께 절편을 제작하였다. 해당 절편은 슬라이드 글라스에 부착한 후, 에어스프레이를 사용하여 매트릭스 용액(70% 메탄올에 50mg/ml 농도의 DHB)을 도포하였다.

이 슬라이드 글라스를 매트릭스 보조 레이저 탈리 이온화(MALDI) 질량분석장치(MALDI LTQ XL, Thermo Fisher Scientific)에 장착하고, 100μm 피치, 포지티브 모드, 질량 대 전하비(m/z) 450~1000 범위로 측정을 수행하였다.

그 후, 전용 분석 소프트웨어(ImageQuest, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 얻어진 m/z 값으로부터 이온 이미지를 작성하였다. 대사산물의 결정은 절편 상에서 직접 다단계 질량분석(MS/MS)을 수행하여 얻은 MS/MS 스펙트럼을 기존 문헌 자료³) 및 표준품의 MS/MS 스펙트럼과 비교함으로써 이루어졌다.

또한, 연속 절편을 헤마톡실린-에오신(HE)으로 염색하고, 질량현미경 분석으로 작성된 각 대사산물의 영상과 비교하였다.

결과 및 고찰

지질의 정성 분석

도축 후 3일 경과한 돼지 등심육(Fig. 1a)에서, 지근, 속근, 지방 등의 각 조직을 포함하는 직사각형 부분을 여러 개 절취하였다. 이 중 일부를 7일간(도축 후 10일째) 숙성시킨 후, 도축 후 3일째 및 10일째의 돼지 등심육 절편을 제작하고 HE 염색을 실시하였다. Fig. 1a에서 분홍색이 짙은 부분을 지근, 연한 부분을 속근으로 판단하였다. Fig. 1b에서 보이는 바와 같이, 지근과 속근은 비슷한 정도로 염색되었으나, 지방 조직은 거의 염색되지 않았다. 또한, 지근과 지방 사이에 짙게 염색되는 부분이 관찰되었고, 본 보고서에서는 이를 ‘농부(濃部)’로 명명하였다. 근육은 지근과 속근 외에도, 이 두 성질의 중간형 근육이 존재하는 것이 알려져 있으며, 향후 면역염색법 등을 통해 이 농부가 어떤 조직인지 확인할 예정이다.

Fig. 2는 돼지 등심육에서 검출된 m/z 450–1000 범위의 질량 스펙트럼이다. 본 실험에서 사용된 DHB를 이용한 질량현미경법으로 동물 조직을 분석할 경우, 이 m/z 범위에서는 주로 지질 유래 피크가 검출되는 것이 알려져 있다. 본 실험에서도 지질에 해당할 것으로 추정되는 다수의 피크가 검출되었다.

다음으로, 이들 피크가 어떤 지질 분자종인지를 결정하기 위해 돼지 등심육 절편에서 직접 MS/MS를 실시하였다. Fig. 3은 검출된 지질의 대표적인 MS/MS 스펙트럼이다. Fig. 3a의 m/z 796.5의 MS/MS 스펙트럼에서는, m/z 값이 전구체 이온에서 -59인 m/z 737.5 및 -183인 m/z 613.5가 검출되었다. 이는 각각 콜린과 포스포콜린의 분자량에 해당하며, 전구체 이온의 m/z 값이 짝수인 점 등을 고려하여, 이는 포스파티딜콜린(PC)(16:0/18:2)의 K 부가체로 판단하였다.

또한, Fig. 3b의 m/z 741.5 MS/MS 스펙트럼에서도 m/z 값이 전구체 이온에서 -59의 m/z 682.4 및 -183의 m/z 558.3이 검출되었고, 이는 각각 콜린과 포스포콜린의 질량수에 일치하였다. 또한 m/z 값이 홀수인 점에서 스핑고미엘린(SM)으로 판단되었으며, 인용 문헌 3)에 따라 m/z 741.5는 SM(d18:1/16:0)의 K 부가체로 보았다.

Fig. 3c의 m/z 496.3 MS/MS 스펙트럼에서는 포스포콜린의 H 부가체에 해당하는 m/z 184.1의 생성 이온이 검출되었고, 전구체 이온의 질량수가 짝수이며 인용 문헌 3)의 내용에 따라 m/z 496.3은 라이소포스파티딜콜린(LPC)(16:0)의 H 부가체로 판단하였다.

또한 m/z 860 이상에서의 홀수 피크는 트리아실글리세롤(TAG)로 보고, 포함된 지방산의 탄소수와 불포화도 합계를 나타내는 것으로 해석하였다. 이와 같은 방법으로, 이온 강도가 높은 순서로 결정된 피크 28개를 Table 1에 제시하였다.

m/z 758.5, 780.5, 796.5는 각각 PC(16:0/18:2)의 H, Na, K 부가체

m/z 760.5, 782.5, 798.5는 각각 PC(16:0/18:1)의 H, Na, K 부가체

m/z 786.5, 808.5, 824.5는 각각 PC(18:0/18:2)의 H, Na, K 부가체

m/z 806.5, 822.5는 각각 PC(18:1/18:2)의 Na, K 부가체

m/z 804.5, 820.5는 각각 PC(18:1/18:3)의 Na, K 부가체

m/z 810.5, 832.5, 848.5는 각각 PC(18:0/20:4)의 H, Na, K 부가체

m/z 812.5, 834.5, 850.6는 각각 PC(18:0/20:3)의 H, Na, K 부가체

m/z 725.5, 741.5는 각각 SM(d18:1/16:0)의 Na, K 부가체

m/z 496.3, 518.3, 534.3는 각각 LPC(16:0)의 H, Na, K 부가체

m/z 520.3는 LPC(18:2)의 H 부가체

m/z 921.7은 TAG(54:4)의 H 부가체

m/z 923.7은 TAG(54:3)의 H 부가체

m/z 919.7은 TAG(54:5)의 H 부가체

이와 같이, 총 7종의 PC, 2종의 LPC, 1종의 SM, 3종의 TAG가 결정되었으며, 하나의 PC, LPC, SM으로부터는 H, Na, K 중 한 가지 혹은 두세 가지의 부가체가 검출된 반면, TAG는 H 부가체만이 검출되었다.

그림 1. 실험에 사용된 돼지 등심육

(a) 디지털 카메라로 촬영한 이미지로, 사각형 부분의 내부를 실험 재료로 사용하였다.
(b) 연속절편의 HE 염색 이미지이다.

상단은 도축 후 3일째 샘플이며, 하단은 10일간 숙성한 샘플이다.
염색 이미지에서 지근(遅筋)과 속근(速筋)이 식별되며, 지근과 지방 사이에는 짙은 색으로 염색된 농부(濃部)가 관찰되었다.

그림 2. 돼지 등심육 절편의 질량 스펙트럼

돼지 등심육 절편에 대해 측정한 질량 스펙트럼으로, m/z 450~1000 범위에서 다양한 피크가 검출되었다.
상대강도(%)는 각 이온의 검출 강도를 나타내며, 피크의 위치와 크기를 통해 다양한 지질 유래 물질의 존재를 확인할 수 있다.

그림 3. 돼지 등심육 절편에서 얻어진 MS/MS 스펙트럼

(a) m/z 796.5의 MS/MS 스펙트럼.
이 스펙트럼은 PC (16:0/18:2)의 K⁺ 부가체에 해당하며, m/z 737.5와 613.5는 각각 프리커서 이온에서 -59 및 -183 Da 손실을 나타낸다. 이 손실은 각각 콜린과 포스포콜린에 해당한다.

(b) m/z 741.5의 MS/MS 스펙트럼.
이 스펙트럼은 SM (d18:1/16:0)의 K⁺ 부가체로, m/z 682.4 및 558.3은 프리커서 이온에서의 -59 및 -183 Da 손실로, 역시 콜린과 포스포콜린의 질량수에 해당한다.

(c) m/z 496.3의 MS/MS 스펙트럼.
이 스펙트럼은 LPC (16:0)의 H⁺ 부가체에 해당하며, m/z 184.1은 포스포콜린의 H⁺ 부가체로 확인되었다

지방질의 시각화

이어서, 숙성에 따른 지방질의 변화를 조사하기 위해 분석 소프트웨어를 사용하여 Table 1에 나타난 지방 분자종의 이온 이미지를 작성하였다. Fig. 4는 세로축에 지방질의 종류를, 가로축에 부가체의 종류를 나타낸 것이다. HE 염색 이미지(Fig. 4o)와 비교한 결과, PC에 대해서는 PC(16:0/18:2), PC(16:0/18:1), PC(18:1/18:3), PC(18:1/18:2) 등의 부가체는 지방 조직에서는 거의 검출되지 않았던 반면, PC(18:0/18:2), PC(18:0/20:4), PC(18:0/20:3)는 세 종류의 부가체 중 하나 이상이 모든 조직에서 검출되었다.

또한 LPC에 대해서는 LPC(16:0)의 각 부가체가 지방 이외의 조직에서 검출되었고, LPC(18:2)의 H 부가체는 속근과 지근에서 검출되었다. PC에 대해서는 어떤 분자종에서도 3일 숙성과 10일 숙성 간에 각 조직에서의 색 농도에 뚜렷한 차이는 보이지 않았으나, LPC(16:0)의 각 부가체 및 LPC(18:2)의 H 부가체는 속근에서 3일 숙성보다 10일 숙성의 색 농도가 짙어지는 경향을 보였다.

LPC는 PC에 결합된 두 개의 지방산 중 하나가 떨어져 나간 구조를 가진다. 이로부터, 숙성 3일째부터 10일째에 걸쳐, 다른 조직에 비해 속근에서 PC의 분해가 더 진행되어 LPC가 증가 축적되었을 가능성이 시사되었다. 또한, 속근에서 보다 많은 유리지방산이 증가 축적되었을 것으로 예측된다. 각 PC의 속근 이미지에서 3일째와 10일째에 거의 차이가 인정되지 않았던 것은, 이미지에서 인식할 정도로 감소하지 않았기 때문으로 생각된다.

그 밖에 SM(d18:1/16:0)의 Na 및 K 부가체는 지방 이외의 조직에서 검출되었으며, 특히 농부(濃部)에서 강하게 검출되었다. 또한 TAG는 지방 조직에서만 검출되었다. 이들 SM 및 TAG의 이미지를 3일째와 10일째에서 비교했을 때 큰 차이는 보이지 않았으며, 이는 숙성 3일부터 10일 사이에 이들의 함량 변화가 작았음을 시사한다.

Fig. 4 지방질의 이온 이미지

본 도표는 질량분석 기반 영상(MALDI-MS imaging)을 통해 돼지 로스 육조직에서 검출된 지방질 분자들의 분포를 시각화한 결과이다.

세로 축은 지방질 분자종을,

가로 축은 각각의 부가체 종류(H⁺, Na⁺, K⁺ 부가체)를 나타낸다.

(a) ~ (g): PC (Phosphatidylcholine) 계열

예: a는 PC(16:0/18:2), b는 PC(16:0/18:1), ..., g는 PC(18:0/20:3)를 나타낸다.

대부분의 PC는 지방 조직에서는 검출되지 않았으며, **근육조직(속근, 지근)**에서만 검출되었다.

다만 PC(18:0/18:2), PC(18:0/20:4), PC(18:0/20:3)는 비교적 모든 조직에서 고르게 검출되었다.

(h) ~ (i): LPC (Lysophosphatidylcholine) 계열

LPC(16:0)는 지방 이외의 조직에서 검출되었으며,

LPC(18:2)는 특히 속근과 지근에서 검출되었다.

**속근에서의 색 농도(상대 강도)**는 숙성 10일 후에 더 짙어졌으며, 이는 LPC 축적의 증가를 시사한다.

(j): SM (Sphingomyelin) 계열

SM(d18:1/16:0)은 지방을 제외한 조직에서 검출되었고,

특히 **농부(농도가 높은 조직)**에서 강하게 검출되었다.

(k) ~ (m): TAG (Triacylglycerol) 계열

TAG(54:5), TAG(54:4), TAG(54:3)는 모두 지방 조직에만 강하게 존재하였다.

숙성 3일차와 10일차 비교 시 큰 변화는 관찰되지 않았다.

(n): 측정에 사용된 육조직의 CCD 이미지

(o): 연속 절편의 HE 염색 이미지

하단의 색상 바는 상대 강도(%)를 의미하며, 어두운 빨강(0%)에서 밝은 빨강(100%)까지로 농도를 시각화하였다.

이 도표는 숙성 기간 동안 특정 조직에서 특정 지방질이 축적되거나 분해되는 양상을 시각적으로 보여주며, 특히 속근에서의 LPC 농도 증가는 중요한 생화학적 변화를 시사합니다. 이는 숙성 중 풍미 성분 생성 또는 식감 변화와의 관련성을 추가로 분석할 수 있는 근거가 됩니다.

요약

이러한 결과로부터, 속근 부위에서의 PC(포스파티딜콜린)의 감소와 LPC(라이소포스파티딜콜린) 및 유리 지방산의 증가·축적이, 숙성 과정에서 돼지 로스 고기의 감칠맛 향상에 일정한 역할을 하고 있을 가능성이 시사되었다. 향후에는 더욱 다양한 대사산물을 분석하기 위해, 매트릭스의 종류나 도포 방법 등의 전처리 조건, 그리고 MALDI-IMS 측정 조건 등에 대한 검토를 수행할 예정이다.

감사의 말씀

본 연구를 수행함에 있어, 귀중한 연구 지원을 해주신 (공익재단법인) 우라카미 식품·식문화진흥재단 및 관계자 여러분께 깊은 감사를 드립니다. 재단의 지속적인 발전을 진심으로 기원드립니다.

참고 문헌

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