신약은 어떻게 만들어지는가
생물의약품 연구개발 프로세스 - 고여욱
[생물의약품 연구개발 프로세스, 고여욱]최근 모더나, 화이자의 COVID-19 mRNA 플랫폼 백신이 FDA의 긴급 사용 승인을 받아 접종이 시작되었습니다. 셀트리온은 COVID-19 항체 치료제의 조건부 사용 승인 신청을 했고 내년 1월말 국내 판매를 기대하고 있습니다.
신약, 그 중에서도 생물의약품 신약은 어떻게 만들어지는 것일까요? 본 책은 생물의약품 신약이 개발되고 임상시험을 거쳐 최종 허가를 받아 시장에 판매되기까지의 과정을 다루고 있는 기본서입니다.
[2장 생물의약품 R&D 프로세스]을 특히 관심있게 읽었습니다. 생물의약품 신약 개발 단계에서 규제기관이 요구하는 자료 및 관련 시험법 [구조 및 물리/화학적, 생물학적 특성분석], [재조합 단백질 의약품 원액의 기준 및 시험법]이 정리되어 있습니다. 재조합 단백질 의약품 제조업에 종사하면서, 의약품 원액의 기준, 시험법 원리 및 해석방법을 파악하고 있는 것은 중요합니다. 단적인 예로 의약품 제조 중 발생할 수 있는 의약품 품질 이슈에 대한 조사 과정에서 시험결과 해석능력은 절대적입니다.
[생물의약품 연구개발 프로세스, 고여욱]에서 간략히 소개했던 생물의약품 분석 기술을 좀 더 자세히 알아보고, 생물의약품 전반에 대한 이해 수준을 한 단계 높이기 위해 다음 독서는 [바이오의약품학, 김홍진, 남두현, 최준석 공저]로 정했습니다.
[바이오의약품학, 김홍진, 남두현, 최준석 공저][1장 생물의약품 산업]
p. 11
"생물의약품" (생물학적 제제 등의 품목허가심사규정, 2조9호)
사람이나 다른 생물체에서 유래된 것을 원료 또는 재료로 하여 제조한 의약품으로서 보건 위생상 특별한 주의가 필요한 의약품을 말하며, 생물학적 제제, 유전자 재조합의약품, 세포배양의약품, 세포 치료제, 유전자 치료제, 기타 식품의약품안전청장이 인정하는 제제를 포함한다.
미 FDA 및 유럽에선 생물의약품을 다음과 같이 부른다.
"Biologics", "Biopharmaceuticals", "Biological product", "Biological medicinal products"
p.13
"생물학적 제제 등"은 다음 표의 생물의약품의 분류에서와 같이 백신, 혈장분획제제, 항독소와 같은 "생물학적 제제"와 유전자 재조합의약품, 세포배양의약품, 세포치료제 및 유전자 치료제로서, 사람이나 다른 생물체유래의 성분으로부터 제조된 의약품을 통칭하여 일컫는 용어이다.
생물의약품은 백신, 혈장분획제제, 항독소를 통칭하여 일컫는 "생물학적 제제"를 제외하고는 주성분인 API (Active Pharmaceutical Ingredient)가 되는 원료물질이 단백질 혹은 펩타이드일 경우 유전자 재조합의약품 혹은 세포배양 의약품으로 분류되고, 주성분이 세포나 조직일 경우 세포 치료제로 분류된다.
또한 주성분이 DNA 혹은 RNA 유전자 성분일 경우나, 치료용 유전자를 함유한 바이러스나 치료유전자가 삽입된 세포주일 경우에는 유전자 치료제로서 분류된다.
p.14
생물의약품 연구개발 프로세스는 다음과 같이 크게 3단계의 과정을 거친다. 1단계로는 후보물질 발굴단계 (Drug Discovery Stage), 2단계는 후보물질의 생산공정 개발 및 동물에서의 안전성 및 약효를 평가하는 생산공정 - 비임상 연구 단계 (Process Development Stage)이고 마지막 3단계는 사람에서의 후보약물의 안전성과 효과를 평가하는 임상시험 연구와 제품 제조허가 판매승인 취득을 위한 임상연구 - 제품제조단계 (Manufacturing Stage)의 과정이다.
생물의약품개발을 위한 신약개발 단계는 다음 그림에 설명된 바와 같이, 타겟창출 => 후보발굴 => 생산공정 개발 => 비임상시험 => 임상시료제조 => 임상시험계획서 제출 및 임상시험 승인 => 임상시험 => 시제품 제조 => 품목제조 및 판매 허가신청 및 승인 => 약가신청 및 의약품 발매의 순차적 개발단계를 거쳐 개발이 진행되는데, 총 개발 기간은 평균 10년에서 14년의 긴 기간이 소요된다.
[생물의약품 연구개발 프로세스, 고여욱]
[생물의약품 연구개발 세부 프로세스, 고여욱]p.20
IND 신청 : Investigational New Drug Application
NDA 허가신청 : New Drug Application
p.23
재조합 단백질인 성장호르몬과 인슐린, 인터페론 알파는 당 성분이 결합되어 있지 않은 단순 단백질로 구성되어 있으므로, 대량 배양이 용이한 대장균 (E. coli, Escherichia coli)이나 효모 (Yeast)를 생산용 숙주세포로 이용하여도 치료 단백질 의약품 약제로서 사용될 수 있지만, 에리스포이에틴이나 항체의약품과 같이 당 성분이 결합되어 있는 당단백질을 제조해야 할 경우에는 CHO 세포 (Chinese Hamster Ovary 세포주)와 같은 동물세포를 이용하여야만 제대로 된 활성과 약효를 나타내는 약물을 제조할 수가 있다.
[구성성분에 의거한 항체의약품의 분류, 고여욱]p.26
항체는 항체를 구성하는 단백질의 유래에 따라, 4종류로 분류되는데, 마우스 단백질 성분이 100%로 구성된 마우스항체, 인간유래 단백질이 70%, 마우스유래 단백질이 30%로 구성된 키메릭 항체, 마우스유래가 약 5% 미만이고 95% 이상이 인간유래 단백질인 인간화항체, 인간유래 단백질 성분만 100%인 인간항체로 분류된다.
p.29
세포 치료제는 크게 세 종류로 분류되는데, 화상이나 흉터, 피부궤양 연골손상 등 조직의 손상으로 인하여 피부나 연골세포의 구조적 회복이 필요할 때, 피부의 각질세포 (연골세포)를 환자로부터 분리, 배양하여 많은 수로 불린 후, 환자의 환부에 처치하여, 이식세포로부터 분비되는 각종 영양단백질 및 재생인자의 작용으로 치료 효과를 보는 1) 피부 (연골) 세포 치료제, 환자의 혈액으로부터 혈구세포를 분리한 후, 다양한 암항원과 접촉시켜, 암세포를 죽일 수 있는 특정 혈구세포인 수지상 세포, NK세포, 활성화 림프구를 다량 생산하여, 다시 환자에 주입하는 2) 면역세포 치료제, 그리고 환자의 조직 및 기관의 기능적 회복을 위하여, 뼈속 골수세포나 제대혈 (출산시의 탯줄 혈액) 혹은 지방세포로부터 성체줄기세포를 분리하거나, 불임치료 후 남은 냉동수정란이나 사산된 태아로부터 추출된 배아 줄기세포를 이용하여 급성 심근경색이나, 연골결손 등의 기능을 회복시켜 주는 3) 줄기세포 치료제로 분류된다.
p.31
줄기세포 (Stem cell)는 스스로 증식하는 자가 재생능력 (Self renewal)과 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력 (Differentiation to specific tissue)을 가진 만능 미분화 세포로서, 배아줄기세포 (embryonic stem cell)와 성체줄기세포 (adult stem cell), 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPS)로 나뉜다.
(...)
일반적으로 수정란은 세포분열을 통해 수정 후 약 4-7일 후에 나타나는 약 100여 개의 세포로 이루어진 포배 (blastula) 상태가 되어 자궁내벽에 착상하게 된다. 이 포배 안에는 내세포괴 (Inner cell mass, ICM)라고 하는 조직부위가 있어서, 이 부위의 세포는 혈액, 피부, 뼈, 심장 등 다양한 조직을 만들 수 있는 능력을 가지게 된다. 이러한 내세포괴의 세포를 분리하여, 특정한 환경에서 배양하면 더 이상 분화는 일어나지 않지만, 분화할 수 있는 능력은 가지고 있는 상태의 배아 줄기세포를 만들 수 있는데, 이 줄기세포주를 이용하여 다양한 치료제 개발이 가능한 것이다.
p.33
유전자 치료제의 성공적인 개발을 위해서는 정상적인 기능을 가진 유전자를 환자의 몸 속 원하는 위치에 정확히 전달할 수 있는 능력을 가진 전달체 (Vector)의 개발이 중요하다. 일반적으로 유전자치료법으로서는 in vitro법 및 in situ법의 두 가지 대표적 방법이 적용된다. 첫 번째 방법인 in vitro법은 환자의 세포조직을 분리한 후, 환자의 세포 내에 치료 유전자를 도입한 세포를 제조하여, 이를 다시 환자의 몸 속에 주입하여 치료하는 방법이고, 두 번째 방법인 in situ 방법은 치료 DNA 유전자 자체 혹은 유전자를 보유한 전달체 (벡터-바이러스)를 직접 질환 부위에 주사하여 주입하는 방법이다.
p.35
백신은 크게 예방 백신과 치료 백신으로 나뉘며, 예방 백신 내에서는 생백신, 사백신, 성분 백신으로 분류되고, 치료 백신의 경우 암 치료 백신이 현재 유일하게 판매허가된 품목이다.
(...)
이러한 생백신은 배양 온도의 변화, 화학제의 처리, 자연숙주와는 다른 숙주세포에서의 장기 계대 배양 등의 처치를 통해서 병원성이 급격히 약화되어 인체에서의 병원성은 나타나지 않으나, 항체 생성 등의 면역원성은 극대화된 백신형태로서, 1-2회 접종만으로도 평생면역이 유지되는 장점이 있다.
(...) 이러한 사백신은 병원성을 완전히 제거, 바이러스나 균체를 불활화하기 위하여 포름알데히드 (Formaldehyde)나 페놀 (Phenol) 혹은 아세톤과 같은 화학제를 처리하거나, 방사선을 쪼이는 등의 처치를 통해서 병원성을 완전히 제거하여 생백신과 같이 병원성의 복귀를 원천적으로 차단하는 장점이 있으나, 면역원성의 유발능력은 생백신보다 현저히 떨어지는 단점이 있으므로, 면역보조제를 첨가하고 최소 3-5회의 다회 투여를 통하여 면역원성을 확보해야 한다.
p.42
(...) 면역조절제 바이오 의약품으로는 인체 내에서 류마티스 관절염의 악화요인이 되는 과량의 TNF-α 단백질에 선택적으로 결합하여 류마티스 관절염의 증상을 대폭 완화시켜주는 엔브렐, 레미케이드, 휴미라와 같은 항체의약품 품목이 거대 바이오 매출품목을 형성하고 있다.
[2장 생물의약품 R&D 프로세스]
p.53
(...)
이 부족분의 단백질을 외부에서 정상 수준으로 보충해주는 경우 대부분의 질병증상은 나타나지 않고 치유되는데 이 경우 치료 단백질을 합성신약에 비교할 경우 아고니스트 (Agonist)라 부르며, 통상 보충요법 (Replacement therapy)에 해당된다.
그러나, 엔브렐과 같은 치료제는 TNF-α 단백질이 과량으로 생성됨으로써 질병이 악화되는데 이의 대표적인 경우가 류마티스 관절염이다. 과량으로 생성된 TNF-α 단백질의 체내 수준을 줄여주기 위하여 인위적으로 TNF-α에 선택적으로 결합하는 항체나 수용체 단백질을 대량으로 제조하여 투여하면, 류마티스 관절염의 증상을 획기적으로 줄여주는 치료효과를 발휘하는데 이러한 치료용 억제물질을 안타고니스트 (Antagonist)라 부른다.
p.55
주성분이 되는 고순도의 단백질 원료를 확보하여 의약품 허가를 취득하기 위해서 생산기술 개발 단계에서는 생산세포주, 발효/배양공정 확보, 정제공정 확보, 분석법 개발, 제제처방 개발, 비임상원료 확보 (주로 활성 및 약효평가용), 구조 및 특정 분석의 7가지 시험 항목을 수행하여야 하며, 비임상 단계에서는 비임상 시료 (주로 완제 처방 형태의 독성시험용) 제조, 기준 및 시험법 확립, 표준품 제조, 효력 및 일반 약리시험, 세포주 뱅킹 및 세포주 특성 분석, 독성평가 및 안정성 시험을 수행하여야 한다.
p.58
개발 후보물질이 당단백질이면서, 당사슬의 말단에 시알산이 존재 시 약효가 충분히 발휘되는 EPO와 같은 제품 혹은 당사슬의 형태와 특정조성이 활성에 주요한 영향을 미치는 경우에 해당되는 항체의약품의 경우에는 미생물이 아닌 CHO 세포주와 같은 동물세포주를 사용하는 것이 필수적이다.
통상 항체의약품이나 에리스로포이에틴과 같은 당단백질을 제조해야 할 경우에는 CHO 세포주가 가장 널리 사용되어지며, CHO 세포주 중에는 CHO DG44나 CHO DUKS 세포주를 모세포 (parental cell line)로 하여 단백질 유전자가 삽입된 발현벡터를 도입 (transfection)하여 생산세포주를 제조하는 것이 일반적이다.
p.59
CHO 세포주에서 발현 단백질이 안정적으로 대량으로 발현하기 위해서는 CHO 세포주에 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한 발현 벡터를 도입 (transfection)시킨 후, 벡터 내 네오마이신이나 제오신 저항성 유전자에 의한 항생제 내성 세포주를 선별하여, 안정적으로 염색체에 삽입된 세포주를 선별하고, 이후 유전자가 증폭되도록 메토트룩세이트의 농도를 단계적으로 높여가면서 유전자의 증폭을 유도하여 단백질 생산성이 향상된 생산세포주를 제조하며, 최종생산 세포주를 이용하여 CHO 세포주의 배양법 및 정제법을 확립하여 목적 단백질을 확보하게 된다. 이 단계에서 구축한 세포주는 주로 RCB (Research Cell Bank)로 명명한다.
p.62
단백질은 온도, pH, 빛, 염농도 등 외부의 환경조건에 따라 쉽게 그 활성이 변성되기 쉬우므로, 먼저 분리된 단백질이 안정적으로 활성을 유지함을 확인할 수 있는 활성측정법을 개발하는 것은 필수적이다. 이를 위해, in vitro cell based assay와 in vivo 활성측정법을 품목별로 개발하여, 의약품의 기준 및 시험항목으로 설정 사용한다.
단백질은 그 표면에 존재하는 염기성 혹은 산성 아미노산에 의한 이온성, 단백질을 구성하는 페닐알라닌 및 트립토판 등의 소수성 아미노산의 페닐링에 의한 소수성, 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 리간드인 Protein A 혹은 특정효소에 특이적으로 결합하는 기질항원과 같은 리간드에 대한 특이적 결합 친화성, 주성분 단백질과 불순물과의 다양한 크기 차이 등의 4가지 분리특성을 보유하므로, 분리하고자 하는 주성분 단백질과 불순물 단백질과의 특성 차이가 큰 칼럼을 적용하여 단백질을 분리하게 된다.
[컬럼 크로마토그래피 적용 (GE Healthcare: Downstream Process 참조), 고여욱)p.65
또한 예기치 않은 바이러스의 오염으로 발현 배양액 내에 불순물로서 바이러스가 혼입될 경우라도, 크로마토그래피 분리정제공정이 오염 바이러스를 효율적으로 제거 및 불활화 시킴을 증명하는 공정 능력을 가질 수 있도록 의약품 용도에 맞는 크로마토그래피 분리 정제 공정으로 디자인하여야 하며, 이 부분은 규제기관인 식약처에서 안전성 확보측면에서 꼭 체크하는 사항이다. 주로 동물세포를 이용하여 재조합 단백질을 의약품화할 경우에는 정제공정이 바이러스의 제거능력 (clearance)을 보증하는 시험자료를 허가자료로 필수적으로 구비하여 식약청에 제출토록 준비하여야 한다.
p.70
미생물 또는 동물세포를 이용하여 재조합 단백질을 발현 시 발현액 내에 존재할 수 있는 불순물의 종류는 상기 표와 같이 크게 3종류로 구분할 수 있다. 1) 제조과정 중 의도하지 않게 도입된 오염물질, 2) 공정관련 불순물질 (Process-related compound), 3) 제품관련 불순물질 (Product-related compound)이 이에 해당된다.
(...)
2)번의 공정관련 불순물질로는 숙주세포로부터 유래된 단백질, DNA, 탄수화물 (당류)과 세포배양공정을 위해 사용된 배지유래의 단백질, 펩타이드, 당류 및 아미노산, 지질성분을 함유한 배지용액, 정제공정을 위해 사용된 완충용액 내 불순물질 (미생물)이 해당되며, 이와 같은 불순물질은 다단계 크로마토그래피 분리정제공정을 적용하여 제거할 수 있다.
3)번의 제품관련 불순물질로서는 주성분단백질의 분해에 의해서 주로 발생하는데 아스파라긴산의 deamidated form, 단백질 내 Methionine oxidation 등의 주성분 변이체가 이에 해당되며, 이러한 불순물질은 주로 분리능이 뛰어난 정제용 HPLC (Preparative HPLC) 컬럼 공정을 적용하여 주성분 변이체를 제거할 수 있다.
p.71
임상 1상 시점에서는 분석법의 밸리데이션까지 허가자료를 요구하지는 않으나 임상 3상 단계 이후의 원액과 제품에 대해서는 시험법의 밸리데이션을 요구하므로 최소한 임상 1상 단계부터 밸리데이션된 시험법의 확립을 위한 준비를 수행하여야 하며 시험법 확보는 일찍 하면 할수록 허가자료 구비에 유리하다.
바이오 신약의 개발에 있어서 가장 먼저 수행해야 할 분석항목은 주성분 단백질의 특성 분석이다. 바이오 신약 후보물질의 특성을 명확히 규명하고 의약품으로서의 허용기준을 규정해 놓아야, 제품의 품질과 일관성을 보증할 수가 있다.
[구조 및 물리/화학적, 생물학적 특성분석, 고여욱]
[재조합 단백질 의약품 원액의 기준 및 시험법, 고여욱]p.72
특히 프로세스 유래 불순물과 주성분 유래 불순물 (변이체)을 구분하여 최종 정제원액 내 프로세스 유래 불순물은 최대한 제거하는 공정개발 노력을 기울여야 한다.
그러나 주성분 유래 변이체 불순물의 경우에는 환경조건 및 시간경과에 따라 발생하지 않을 수 없으므로, 이 주성분 유래 변이체의 불순물의 수준을 파악하여 품목별로 최대한 확보 가능한 순도의 수준을 가늠하는 것이 중요하다.
[3장 생물의약품 제품생산 프로세스]
[4장 생물의약품 비임상시험 프로세스]
p.93
이상적인 약물은 약효가 우수하고 (potent and efficacious), 질환 타겟에만 특이적 (specific)으로 작용함으로써, 질환부위 이외에는 작용하지 않아 부작용 (side effect, toxicity)이 최소화되어야 한다.
p.94
(...) 합성의약품과는 달리 종특이성 및 타겟 특이성이 크므로, 생물의약품의 약리작용이 작동될 수 있는 종을 선정해야 하는 것이 비임상시험에서 중요하게 고려해야 할 요소이다.
예를 들어 인간항체의 경우, 마우스나 쥐와 같은 이종에 투여 시, 항체와 결합하는 설치류의 항원이 사람의 항원과 많이 다를 경우, 제대로 된 항체의 약리작용을 살펴보기가 어렵게 된다.
p.95
생물의약품의 비임상 약리작용에 관한 시험항목으로는 효력시험 (Efficacy) 및 안전성 약리시험과 약물동태시험 (PK, Pharmacokinetic profile) 및 기타 약리작용에 관한 시험이 있으며 임상 및 품목 허가 시 식약청에서는 하기 시험항목을 요구한다.
[생물의약품의 비임상시험, 고여욱]2. 약리작용에 관한 시험
p.96
1) 약물동력학 (약력학)
식약청에서 언급하는 효력시험은 약물의 효과 (drug effect)를 보는 시험으로서, 일반적으로 약력학 혹은 약물동력학 (Pharmacodynamics, PD)이라 부른다.
약물의 효과는 일반적으로 약물의 용량 증가에 따라 비례하여 약리작용이 강하게 나타나는 경향을 그림에서와 같이 보이며, 대개는 포물선과 유사한 형태로 전개되며, 이를 대수열 축 위에 그려보면 S자형의 그래프로 나타난다. 이와 같이 효력시험의 약물용량-반응 (dose-response curve) 또는 약물농도-효과 (dose-effect) 간의 관계 그래프를 용량-반응 곡선 (dose-response curve)이라고 한다.
PD, 즉 효력시험은 약물의 효과발현의 작용기전을 밝히는 연구를 통상 세포 등을 이용한 in vitro 시험계와 실험동물을 이용한 in vivo 시험계를 이용하여, 저농도, 중농도, 고농도 등 다양한 농도의 약물을 처리한 후 약물의 용량 (dose) 대비 효과 (response effect)에 관한 상관관계를 결정하여, 약물로서의 유효한 효과를 확인하는 시험이다.
p.98
2) 약물의 동태시험 - 약물동태학 (약동학, Pharmacokinetics, PK)
약물이 효능을 발휘하기 위해서는 약물을 체내에 투여 후 타겟에 충분히 도달되도록 해야 한다. 생물의약품의 경우 주성분의 구성 성분이 대부분 펩타이드나 단백질로 이루어져 있으므로, 경구로 투여 시에는 위나 장에서 대부분 세포 내에 있는 단백질 분해효소에 의해 분해되므로 주성분의 약효를 충분히 발휘할 만큼 경구투여로는 체내로 주입하기가 어려워, 지금까지 발매된 대부분 생물의약품의 제형은 주사제 제형으로서 정맥 내 주사 (iv 주사, intravenous)나 피하주사 (SC 주사, subcutaneous) 혹은 in-fusion으로 투여하는 경우가 대부분이다.
비임상 약리작용의 주요 평가항목의 하나가 PK (Pharmacokinetics) 즉 약물동태시험으로서, 약물의 체내 투여 시 약물의 체내흡수 (Absorption), 분포 (Distribution), 대사 (Metabolism), 배설 (Excretion)의 동태를 평가하는 시험으로 ADME 시험 (약물동태시험)이라고도 부른다.
단백질 성분으로 구성된 대부분 생물의약품의 경우, 대개 체내에 있는 내재 단백질과 동일하게 아미노산의 연결쇄로 구성되어 있으므로, 체내에 분포 후 대부분 비특이적 단백분해효소에 의한 분해과정을 거친다. 따라서 치료단백질의 생물의약품은 합성의약품과 같이 통상적인 간에서의 산화적 약물 대사를 거치지 않고 단순하게 펩타이드나 아미노산 형태로 분해되어 대사과정이 단순하고 예측 가능하다.
또한 단백질 의약품은 대부분 세포 표면에 있는 수용체의 타겟 단백질에 특이적으로 결합하는 형태가 많고, 대부분의 단백질 의약품은 수용체에 결합 후, 세포 내로 들어간 후에 분해되어 제거되는 단순한 대사 경로를 보인다.
단백질 의약품의 대표적인 약물동태시험은 약물을 단회 및 반복 투여하여, 시간 경과에 따른 약물의 체내 혈중농도를 측정하여, 체내에서 흡수 후 대사되어 소실되는 프로파일을 파악하는 시험으로서, 이 실험을 통하여 투약 후 시간에 따른 약물농도의 합 AUC (Area under curve), 반감기 (Half life), 최고혈중농도 (CMAX) 등을 측정하여, 약물 투여 시 시간경과에 따른 최적의 약물의 효능을 나타내는 약물 유효농도를 결정할 수가 있다.
단백질의 PK 시험을 위해서는 혈액 내에 존재하는 투여된 단백질 약물의 혈액 내에서의 함량을 측정하기 위한 정량 시험법을 확립하고, 이 시험법을 검증하는 시험 (밸리데이션)을 수행하여야 한다. 일반적으로 이 시험법은 투여 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 ELISA (Enzyme linked Immunosorvant assay) 시험법을 적용하여 정량한다.
3. 독성 작용에 관한 시험
p.100
1) 단회투여 및 반복투여 독성
일반적으로 독성시험은 치사용량 (LD50, Lethal dose 50: 시험동물의 50%를 치사시킬 수 있는 약물용량) 및 무독성용량 (NOEAL)을 확인하기 위하여, 통상 임상 투여용량의 10배 혹은 100배 등의 고용량으로 시험물질을 투여한다.
단회투여를 통한 급성독성시험의 목적은 반복투여 시의 용량결정, 독성에 영향을 받는 장기의 확인, 인간에서의 임상시험의 초기용량 설정 등을 찾고자 수행하는데, 통상 설치류 1종 (마우스 혹은 랫드)과 비설치류 1종 (토끼 혹은 개, 원숭이)을 대상으로 시험하도록 권고하고 있다.
(...)
단회투여 시의 투여 경로는 일반적으로 2개의 경로로 시험하게 되며, 사람에서의 투여 경로와 동일한 투여 경로를 반드시 해야 하고, 다른 한 경로로는 사람에의 노출도가 가장 큰 정맥 내 투여가 고려되어지고 암수로 나뉘어 평가한다.
반복투여 독성시험의 경우에도 일반적으로 2종의 동물종을 선정하여 시험하는데 이 시험의 목적은 장기간에 걸친 약물투여 시의 만성적 독성 (long-term effect)을 평가함에 있다.
2) 생식발생 독성
본 시험의 목적은 시험약물이 생식에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위함이다.
3) 유전독성 시험
유전독성 시험은 신약후보물질이 유전자에 돌연변이를 야기할 수 있는지를 결정하는 시험법이다.
4) 발암성 시험
발암성 시험은 신규약물이 암을 발생시킬 수 있는 잠재능이 있는지 여부를 확인하는 방법이다. (...) 수집하는 시험 데이터는 주로 호르몬 수준, 성장인자류의 발현량, 조직 내 효소들의 활성 등에 대한 항목들이고, 최종 투여 후에는 쥐를 죽인 후 각 조직을 검사하여 암 유발 여부를 검사하게 된다.
5) 항원성 시험
항원성 시험은 시험물질의 주성분이 항원으로서 작용하여 나타나는 항체 생성 등의 면역원성을 시험하는 항목이다. 인간유래 재조합 단백질의 경우 동물의 유래 단백질과 비교 시 아미노산이 완전히 동일하지 않으므로 종간 차이가 클 경우에는 실험동물에 반복 투여 시에는 대부분 항체가 형성된다.
따라서 동물에서의 실험 결과로부터 인간에서의 항원성 즉 면역원성을 예측한다는 것은 사실 실질적인 의미는 없지만, 항체 형성 등의 면역반응 발생에 따른 파급효과 즉 투여의약품의 주성분 단백질의 중화에 따른 활성의 감소 혹은 동물에서의 쇼크 등 부작용의 발생수준과 강도를 판단함으로써, 인간에의 투여 시 발생할 수 있는 부작용의 강도와 범위를 예측하는 데 도움이 된다.
생물의약품의 경우 면역원성은 크게 2종류로 구분하여 항체 형성 여부를 확인해야 하는데 그 하나는 주성분 치료단백질의 효력과 활성에 영향을 미칠 수 있는 타겟과의 결합부위에 대한 항체가 형성되는 경우 (이 경우 중화항체가 형성되는 경우임)와 주성분의 활성효력과는 상관없는 단백질의 여타부위에 항체가 형성되는 경우로 구분된다.
생물의약품의 경우 면역원성 시험을 부작용 모니터링 항목 중 중요한 시험항목 중의 하나로 평가하고 있다. 특히 사람의 몸 속에 있는 내인성 단백질과 거의 구조적으로 동일한 재조합 단백질의 경우에는 항체 형성의 가능성이 적다. 그러나 체내 반감기를 늘리기 위하여 폴리에틸렌글리콜이나 다른 융합단백질과 같은 물질을 재조합 단백질과 결합시켜 제조할 경우에는 해당 재조합 단백질의 입체구조의 변화가 발생할 경우에 기존에 체내에 존재하는 내인성 단백질에 대한 항체 형성의 발생 위험이 있다. 따라서, 오히려 부작용으로 체내 내인성 단백질의 제거에 따른 질병 발생의 위험성이 있어, 비임상 및 임상단계에서 항체 형성에 따른 부작용 생성 가능성에 대한 세심한 검토가 필요하다.
6) 면역독성시험
항체를 포함한 인간 재조합 단백질 의약품의 면역독성시험은 시험물질이 면역계에 이상을 일으키는지 여부를 확인하는 시험 항목이다. 주로 반복투여 독성시험에서 면역독성의 발생을 확인한다.
7) 국소독성시험
[5장 생물의약품 임상시험 프로세스]
1) 임상 1상 시험
임상 1상 시험은 임상 약리시험 (Human pharmacology studies)으로도 불리워지는데, 제1상 시험의 주목적은 시험약물의 인간에 대한 안전성을 평가하기 위함이다.
임상 1상은 비임상시험 결과를 근거로, 투여용량을 가장 낮은 농도에서부터 단계적으로 올려가면서 정상인을 대상으로 투여하여, 약물의 안전성과 내약성을 평가하고 단독 및 반복투여에 따른 약동학 (Pharmacokinetics) 및 약력학 평가를 수행, 약물의 작용 및 약물대사와 치료효과의 추정 등을 연구 목적으로 한다.
(...)
보통 임상 1상에서는 항암제의 시험을 제외하고는 통상 정상인을 대상으로 시험하게 되는데 환자수는 평균 20명에서 100명 범위에서 시행한다.
2) 임상 2상 시험
임상 2상의 목적은 타겟이 되는 질병에 대한 유효성과 안전성을 평가함을 목적으로 한다. 보통 임상 2상은 시험약과 함께 대조약을 가지고 시험하게 되는데, 음성 대조약 (placebo, 약물의 효과가 없는 물질)을 사용하거나 현재 사용되는 표준 치료약을 대조약으로 사용한다.
(...)
임상 2상은 더 자세히는 임상 2상a2의 전기 2상과 임상 2상b의 후기 2상으로 나뉘어 시험하게 되는데 임상 2상a는 주로 소수의 환자를 대상으로 한 약물의 Proof of Concept (POC)를 입증하기 위한 연구와 용량 결정을 위한 탐색 연구이다. 반면, 임상 2b는 보다 많은 환자를 대상으로 하여, 3상 임상을 위한 치료적 약물 용량을 결정하기 위한 유효성 평가 시험이다. 즉 후기 2상 시험에서는 환자에서의 약물 투여용량과 반응관계를 탐색하여 최적용량을 결정하는 데 주안점을 둔다.
결국 2상 시험을 통해서는 약물의 유효성을 나타내는 적정농도, 용량, 투여 빈도 및 투여 기간 등을 파악할 수가 있다.
임상 2상에서는 임상결과에 대한 피험자 및 평가자의 주관적인 편견이 시험 결과에 반영되지 않도록 하기 위하여, 피험자가 어떤 약을 투여 받는지 모르도록 single-blind trial을 수행하거나, 혹은 평가자 및 피험자 모두 어떤 약을 주사 받는지 모르는 double-blind trial (이중맹검)을 수행하여 평가하기도 한다.
임상 2상에서는 투여용량에 따른 질병이 치료되는지 여부를 파악하기 위한 결정시험이므로 이를 판단하기 위한 clinical endpoint marker가 사용된다.
항암제의 경우에는 직접적인 치료효과는 사망률 (mortality)을 측정하는 것이고, 간접적으로는 surrogate marker로 암의 크기의 감소 혹은 암 연관 단백질인 p53, TGF-α, VEGF 등이 될 수 있다.
임상 2상은 보통 1년에서 2년이 소요되며, 환자수는 보통 50명에서 500명 범위 내에서 수행하게 된다.
3) 임상 3상 시험
임상 3상 시험은 임상 2상의 확장 개념이므로, 여러 병원에서 수행하여, 다양한 인종간 반응의 차이, 지역별 반응의 차이, 세밀한 질환 대상군에 따른 약물의 반응을 다양한 각도에서 평가하게 되며, 환자의 자유배정 (randomization)과 이중맹검 (double-blind trial) 시험을 통해 평가하게 된다.
(...)
만일 시험결과가 효과면에서 기존 치료법보다 의미있는 이점을 제공해주지 못하면, 반응성이 더 좋은 그룹으로 처리대상을 세분화하여 보다 광범위하고 세밀한 임상 3상 시험을 수행하여야 한다. 임상 3상 시험을 통하여 최종적으로 정확한 대상 질환 타겟 환자군의 선정, 투여용량, 치료빈도 및 치료기간의 정확한 설정이 가능하게 된다.
4) 임상 4상 시험
임상 4상 시험에 대해 국내 식약청에서는 "치료적 사용시험"이라고도 부르는데 본 시험의 목적은 임상 3상 시험으로 투여한 시험기간보다 더 오랜 기간 동안 치료약물을 환자에 투여해야 할 경우의 안전성 (long-term safety)을 확보하기 위함이다. 장기간 환자에 투여 시에 임상 3상 기간 동안에 나타나지 않았거나 확인하지 못했던 중대한 부작용의 발생을 4상 시험을 통해 확인한 경우에는 시판 허가한 약물이라 하더라도 규제기관은 약물의 판매 및 사용을 중지시킬 수가 있다.
[6장 생물의약품 허가 프로세스]
p.119
생물의약품의 임상시험을 완료하여, 의약품으로서의 효능과 안전성이 검증되게 되면 최종적으로 의약품의 제조 및 판매 허가를 취득하기 위한 NDA 프로세스를 밟아야하는데 이 과정을 NDA 신청, 영어로는 New Drug Application이라 부른다. 특히 미국에선 생물의약품의 경우 BLA (Biologics License Application)로 구분하여 부르기도 한다.
p.122
CMC는 Chemistry, Manufacturing and Control의 약자로서, 식약청에서는 생물의약품의 임상 및 판매를 허가해주기 위해서, 생물의약품 원료에 대한 구조, 구성성분, 물리화학적 및 생물학적 성질에 관한 자료, 제조공정에 대한 기술자료, 원료의 기준, 시험방법 및 그 근거에 관한 자료, 시험성적서에 관한 자료, 표준품의 규격 및 관리 방법, 설정근거에 관한 자료, 원료보관 용기 및 포장에 관한 자료 등 광범위하게 원료 분석자료에 대한 정보를 포함하는 CMC 자료를 제조회사가 제출토록 요구한다.
[재조합 단백질 의약품 CMC 구비항목 (품질), 고여욱]p.124
생물의약품의 비임상자료 구비항목으로서, 하기 표에 제시된 바와 같이 크게 약리와 독성자료로 대별된다. 약리자료로서는 크게 약효 자료 (Pharmacodynamics, PD)와 약물동태 (Pharmacokinetics, PK) 자료를 구비하여야 하며, 이외의 다양한 안전성 약리시험 자료를 구비하여야 한다.
단순히 말하면 PD는 질환 타겟에 대한 약물의 작용을 다루는 반면에, PK는 약물에 대한 신체, 몸의 반응을 다루게 된다. 또한 비임상 단계에서의 독성연구는 말 그대로 약물의 신체에 미치는 독성의 정도를 평가하여 약물로서의 잠재성이 있는지 여부를 판단하게 된다. 즉 비임상 단계에서의 PD, PK 및 독성 자료는 임상시험을 위한 약물의 적정 투여용량 및 투여방법에 대한 정보를 제공해 준다.
[재조합 단백질 의약품 비임상시험 항목, 고여욱]
[재조합 단백질 의약품 임상시험 항목, 고여욱]