(2) 미생물의 보존

-제22차 아시아미생물은행연맹(ACM) 컨퍼런스 및 총회 후기

작년 5월에 제22차 아시아미생물은행연맹 컨퍼런스 및 총회(ACM22)를 농업미생물은행(KACC)에서 주최하였다. 매우 시사하는 바가 많은 행사인데 연중에는 시간이 없어 정리를 못하다가 연말연시에 시간을 내어서 정리하고 있다. 미생물은행 운영을 포함하여 여러 이슈가 있는데 한번에 다 언급할려니 너무 길고 몇 개로 나누어서 이야기해 보고자 한다. 먼저 미생물 보존부터 시작해 보자.

ACM22에서는 21개의 구두발표와 29개의 포스터발표가 있었는데 그 중에서 미생물 보존은 일본 산업성미생물은행(NBRC)의 Sato masanori 박사의 구두발표 ‘미생물 보존: 기술, 활용 및 관리’ 단 하나였다. 하지만 매우 강렬하였고 내게 ACM22에서 최고의 발표가 뭐냐고 물으면 이 발표라고 대답할 것이다. 참가자 모두에게는 모르겠지만 최소한 내게는 이 발표가 가장 인상적이었다.

(ACM22 Sato 박사 발표 자료)

1995년 농업미생물은행(KACC)이 설립되었을 때에 우리나라에서 미생물 보존에 대하여 제대로 된 기술을 가진 곳은 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, 지금은 생물자원센터) 뿐이었다. 미생물 보존에 대한 경험도 없는 비전문가로 구성된 KACC에서 농업미생물자원 관리의 미션을 받았으니 KCTC에 가서 보존법을 배워 오는 수밖에 없었다. KCTC에 가서 동결건조보존 기술을 배워왔다.

그런데 KCTC는 세균에 더 전문성을 가진 미생물은행이다. 하지만 농업미생물은행이 관리해야할 미생물은 식물병원성곰팡이와 버섯 등 대부분 곰팡이다. KCTC에서 배워온 기술은 농업미생물, 곰팡이에 적용은 한계가 있었다.

당시의 농촌진흥청에는 식물병원성 미생물을 연구하는 식물병리과, 해외병해충과, 그리고 버섯을 연구하는 균이과가 있었다. 이들 부서에서는 많은 미생물들을 분리하지만 실험기간 동안 계대배양으로 보관하다가 실험이 끝나면 사라지는 형국이었다.

해외병해충과의 이영희 박사님 등이 농업미생물의 장기보존의 필요성을 인식하고 관련 기술을 세팅하고자 노력하였다. 일본농림수산성에서 나온 ‘미생물의 장기보존법보존(농업환경기술연구소, 1987)을 한글로 번역하여 배포하였고, 당시에 곰팡이 보존의 선두그룹이었던 영국의 IMI에서 발간된 책(Smith and Onions, 1994.)을 무단으로 복사제본하여 공유하였다(그때는 저작권에 대한 개념이 희박하였다). 하지만 전담으로 미생물을 관리하는 연구자가 없다보니 계대배양 그리고 막 나오기 시작한 초저온냉동고에 미생물을 중·단기간 보존하는 수준이었다.

곰팡이 보존 워크숍 1997 (앞줄 우측에서 두번째 분이 이영희 박사님)

농업미생물은행은 식물병리과도 버섯과도 아닌 지금으로 따지면 농업생명부의 분자유전과에 설립이 되었다. 나는 곰팡이 자원 관리의 미션을 부여 받았는데 곰팡이의 보존은 말할 것도 없고 곰팡이의 분류에 대하여도 가르쳐 줄 선배가 분자유전과에는 없었다. 그래서 위에 언급하였듯이 KCTC, 식물병리과에 등을 다니며 미생물의 보존과 분류를 배웠다.

당시는 인터넷도 없었고 오직 책자에 의존하여 배워야 하였다. 위에서 언급한 일본 농림수산성 책자와 영국 IMI에서 발간한 책을 열심히 읽었다. 하지만 혼자서 하는 데는 한계가 있었다.

2001년에 좋은 기회가 왔다. 세계최대 곰팡이은행 Westerdijk 연구소에서 1주일자리 곰팡이 분류 연수 기회가 주어졌다. 처음 경험한 선진 미생물은행은 그야말로 신천지였다. 결국 2002년부터 3년간 Westerdijk 연구소와 국제공동연구를 하게 되었다. 당시에 곰팡이 보존연구를 전담하던 Tan 박사님과 보존팀장인 Stalper 박사님으로부터 일반 곰팡이 보존에 대하여 제대로 배울 수 있었다.

미생물 보존에 대하여 자신감을 갖게 되니 또 하나의 미생물 보존 강국인 일본에 대하여 관심을 갖게 되었고 결국 2006년 일본경제산업성 미생물은행(NBRC)을 방문하게 되었다. NBRC의 Akira Nakakiri 박사님은 버섯 보존의 전문가였는데 보존법을 자세히 설명해 주었다. 이로 인하여 나름 서양과 동양의 미생물 보존에 대하여 모두 경험할 수 있었다. 하지만 종합적이지는 못하고 아직은 중간에 빵구가 듬성듬성 있고 연계가 부족한 느낌이 있었다.

미생물보존에 대한 이러한 파편적인 지식을 연계해준 것은 예상치 못한 데서 왔다. 2006년 12월에 태국의 TBRC(당시는 BCC)에서 ‘미생물은행 품질관리를 위한 워크숍’이 있었다. 연초에 계획된 출장이 아니어서 기대를 하지 않고 신청하였는데 당해연도에 사용하지 못한 해외출장비가 있어 요행히 선정되었다.

이 워크숍에서 Nakagiri 박사님이 ‘동결법과 진공건조법에 의한 곰팡이의 보존’에 대하여 1시간 강의하였다. 지금도 기억이 생생할 만큼 미생물 보존에 대하여 전반적으로 잘 정리하여 주었다. 선생님의 강의는 얼마나 잘 조직화되고 합리적이었든지 영어가 부족한 내게도 한 단어도 빠지지 않고 머리에 쏙쏙 들어와 박혔다. 강의 후에 선생님의 배려로 강의 파일을 받을 수 있었고 돌아와서 다시 꼼꼼하게 복습하였다.

2006 TBRC 워크숍 (왼쪽 첫번째가 Dr. Nakakiri)

이 때에 미생물 보존에 대한 체계를 만들 수 있었다. 그 이후로 국내에서 미생물 보존에 대하여 강의 기회가 있으면 내가 맡게 되었다. 강의 내용은 Nakagiri 박사님의 발표자료 뼈대 위에 Westerdijk의 내용이 추가되고 한국에서의 경험들이 조미된 정도임을 실토한다.

이번 Sato 박사의 강의는 20년전 Nakagiri 박사님의 강의에 버금갈 만큼 인상적이었다. 2006년의 Nakagiri 박사로부터 받은 자료 이후에 나의 미생물 보존 강의자료는 거의 업데이트가 되지 않았다. 그런데 Sato 박사는 그 이후의 일본의 곰팡이 보존연구를 잘 정리해 주었다.

서론이 매우 길었는데 Sato 박사의 강의를 소개한다. 이왕 미생물 보존에 대하여 판이 펼쳐졌으니 강의 내용 외에도 미생물 보존에 대한 나의 지식도 일부 추가한다.

Sato 박사의 강의는 미생물의 보존법에 대한 리뷰로 시작한다.

ACM22 Sato 박사 발표 자료

미생물보존 강의 슬라이드(저자)

위가 Sato 박사의 발표자료이고 아래가 내가 강의에 사용하는 슬라이드이다. 이들을 바탕으로 미생물의 보존법에 대하여 간단히 설명하고 시작하자.

미생물 보존의 기본은 계대배양보존법(Serial transfer)이다. 대를 이어서 배양하고 보존한다는 의미인데 접종 후에 배양하고 다 자라면 그 상태로 일정기간 보존하였다가 다시 새로운 배지에 접종하고 배양하고 보존하고를 반복하는 것이다. 배양 상태를 그대로 유지한 채로 보존하니까 오랜기간 보존할 수가 없다.

따라서 미생물을 더 장기간 보존하기 위한 처리가 필요하다. 미생물이 자라면 늙고 늙으면 죽는다. 미생물이 죽지 않으려면 늙지 않아야 하고 늙지 않으려면 생장을 하지 말아야 한다. 미생물이 생장하지 못하게 하는 방법은 생장에 필요한 요소를 공급하지 않는 것이다. 가장 쉽게 생각할 수 있는 것이 호흡을 못하게 산소를 차단하는 것이고, 생물대사에 기본인 물을 제공하지 않는 것이고 그리고 생물대사에 필요한 에너지를 제공하지 않기 위하여 온도를 낮추는 것이다.

미생물 보존의 기본인 계대배양보존에서 산소를 차단하기 위하여 물이나 기름으로 미생물을 덮는 것을 중층법이라고 한다. 그리고 산소뿐만이 아니라 물까지 차단하는 것이 진공건조법이다. 그리고 온도를 툭 떨어뜨려 생물대사를 할 수 있는 기본 에너지를 제공하지 않는 것이 동결법이다. 보존 기간은 미생물에 따라 차이가 있지만 중층법은 중·단기간, 진공건조법과 동결법은 장기간이다.

중층법은 시험관에 배양된 미생물에 물과 기름을 채우고 15도씨에 보관하고, 진공건조법은 미생물을 유리앰플에 넣어 동결건조한 후에 4도씨에 보관하고, 동결법은 미생물을 10% 글리세롤에 담근채로 –80도씨 또는 –196도씨에 보관한다. 보존 비용은 중층법<진공건조법<동결법 순이다. 오랫동안 미생물을 보존해야 하는 미생물은행은 돈이 들더라도 동결법과 진공건조법을 사용해야 하고, 단기간 미생물을 사용하는 대학과 연구소에서는 중층법을 선호한다.

그리고 보존에 대하여 더 알아 두어야 할 것이 진공건조법은 세포에서 물을 쪽 빼는 것인데 복잡한 구조를 가진 고등생물에서 물을 빼버리면 세포간 연결이 깨져서 복원이 어렵다. 따라서 단일 세포로 자라는 세균이나, 곰팡이의 경우에는 단순한 세포구조를 가진 포자만 보존이 가능하다. 즉 진공건조법은 세균과 포자형성 곰팡이로 적용 범위가 제한적이다. 그런데 진공건조법은 보존 비용이 동결법보다 적게 들고 무엇보다도 일단 진공건조하여 앰플을 만들게 되면 실온에서도 유통이 가능해진다. 따라서 분양을 많이해야 하는 미생물은행은 동결법보다 건조법을 선호한다.

보존의 일반에 대한 이야기가 길어지니 지루한데 더 자세한 내용은 농업미생물은행(KACC)의 곰팡이 보존(신과 홍, 2014; 국립농업과학원, 2020)을 참고 바란다.

농업미생물은행의 곰팡이의 보존(신과 홍, 2014)

일본 NBRC의 미생물의 보존법 선택 (ACM22 Sato박사 발표 자료)

일본 NBRC의 미생물보존법 사용 현황이다. 세균은 단순한 세포를 가졌기에 진공건조법으로 보존이 가능하고 건조법이 동결법에 비하여 위에 설명한 장점이 있기에 진공건조법을 선호한다. 곰팡이는 건조법을 쓰고 싶으나 실험실에서 배양 시에 포자를 만들지 않는 균주가 많아 건조법은 1/4정도만 하고 나머지는 동결법을 사용하였다. 효모는 곰팡이지만 단순한 단일 세포로 자라기에 100% 건조법으로 가능하다. 조류(藻類, algae)는 구조가 복잡한 다세포 생물이라 이도저도 안되고 그냥 계대배양하고 있다.

실제 미생물을 보존해 보면 세균은 보존에 큰 어려움이 없다. 문제는 곰팡이다. 곰팡이 중에서도 포자를 많이 만들어 공기 중에도 떠다니는 접합균과 자낭균은 문제가 없고 식물가 공생하는 송이버섯과 같은 버섯이 문제다. 그리고 하나 더, 실제 곰팡이가 아니고 조류(藻類)이지만 균학자들이 곰팡이처럼 다루는 역병균과 같은 난균문(Oomycota)이 보존에 어려움이 있다.

미생물 보존법의 선택 과정(ACM22 Sato박사 발표 자료)

NBRC에서 사용하는 곰팡이 보존 방법의 선택 과정이다. 매우 잘 요약된 그림이다. 설명하면 포자를 만드는 곰팡이는 위에서 설명한 바대로 건조법(L-drying)을 사용한다. 포자를 만들지 않는 곰팡이는 동결법으로 가는데 보존이 무난한 자낭균과 접합균은 –80C의 초저온냉동고(Deep Freezer, DF)를 사용하고, 보존이 까다로운 버섯(담자균)과 조류(난균)는 –150C이하의 액체질소 탱크에 보존한다. 이것이 곰팡이 보존의 일반적인 방법이다.

그런데, 일부 버섯은 현재까지 개발된 최고의 보존법인 액체질소보존에서도 살아남지를 못한다(그림의 가장 오른쪽). 그래서 할 수 없이 가장 단순한 보존법인 계대배양보존법을 사용하고 재보존한다. 힘들어도 6개월마다 재보존을 할 수는 있는데, 문제는 한번 보존할 때마다 곰팡이의 유전형이 바뀌고 활력이 떨어져서 수십년이 지나면 곰팡이가 매우 허약해진다. 이같이 액체질소 보존이 안되는 곰팡이가 송이, 능이와 같은 외생균근 버섯들이고 하필이면 비싸고 돈되는 곰팡이다.

여기까지가 미생물 보존에 대하여 기존에 알려진 것들이고 20년전에 나가키리 박사가 정리해서 발표한 것으로 한국에도 알려진 내용이다. 이번에 Sato 박사가 발표한 내용은 이를 바탕으로 해서 액체질소보존이 잘 안되는 이 외생균근 버섯의 보존법을 개발한 것이다.

우리가 곰팡이를 액체질소에 보관할 때에 페트리디쉬에 곰팡이를 키운 후에 칼로 잘라서 10% 글리세롤이 들어있는 바이얼에 넣고 이 바이얼을 액체질소에 넣어 보관한다. 그런데 기존 연구에 의하면 곰팡이를 키울 때에 어떤 배지를 사용하느냐에 따라 보존효과에 차이가 있다. 일반적으로 곡물과 같은 천연배지를 사용하면 인공 합성 배지에서 키운 것보다 보존 효과가 좋다.

Sato 박사의 연구는 이에 착안하여 더 발전된 연구를 하였다. 보존이 잘 안되는 곰팡이를 단순 배지가 아니라 펄라이트(Perlite), 버미큘라이트(Vermiculite) 같은 구운 광석에서 키워서 액체질소 보존하는 것이다. 이들 광석을 고온에서 구우면 뻥튀기가 되어 구멍이 많아지고 가벼워진다.

이들 구멍이 많은 구운 광석에 곰팡이가 자랄 영양분을 넣고 멸균한 후에 곰팡이를 접종하고 키운 다음에 여기에 보존제를 넣어서 액체질소에 보관하는 것이다. 실험결과 구운 광석으로는 버미큘라이트가 효과가 좋았으며 보존제로는 단순히 10% glycerol 보다는 5% DMSO와 10% Trehalose를 사용하였을 때에 결과가 더 좋았다(Sato 등, 2020; Sato 2024).

버미큐라이트를 이용한 버섯의 액체질소보존(ACM22 Sato 박사 발표 자료)

액체질소 버미큐라이트 보존은 단순히 생존율을 높인 것만이 아니라 곰팡이의 활력도 단순 액체질소보존과 다른 방법에 비하여 매우 우수하였다.

버섯의 버미큐라이트 이용 액체질소 보존 결과(ACM22 Sato 박사 발표자료)

Sato 박사의 연구결과는 정체되어 있는 곰팡이 보존 연구를 진일보 시킨 매우 의미있는 결과이다. 게다가 외생균근 버섯은 송이, 능이 버섯과 같은 돈되는 버섯이 많아서 실제 경제적 파급 효과가 있을 것이다.

이것으로 제22차 아시아미생물은행 컨퍼런스의 미생물 보존 부분 소개를 마치고자 한다. 펜을 놓기 전에(참으로 구식 표현이다) 그래도 30년간 미생물 보존 업무를 했는데 이 분야에 대하여 우리가 나아갈 방향에 대하여 사족을 붙이고자 한다.

미생물 보존은 기술적으로 어려운 것도 아니고 노동력이 많이 드는 것도 아니다. 쉬운 일이다 보니 오히려 신경을 쓰지 않고 오래동안 잊혀졌다가 쓸려고 보면 죽어 있다. 농업미생물은행을 운영하면서 대단한 것은 아니지만 몇권의 책을 썼다. 어떤 책은 20년 전에 출판했다. 그런데 필요해서 내가 쓴 책을 찾아보면 어디가고 없다. 쓴 당시에는 연구실이건 집이건 흔하게 꽃혀 있던 책이다. 결국 그 책을 농촌진흥청 도서관에 가서 빌려본다.

미생물도 마찬가지다. 실험할 때는 흔하다. 냉장고 문만 열면 항상 거기에 있었다. 그러나 1년이 지나고 5년이 지나고 10년이 지나면 그 늘 쓰던 미생물을 찾을 수가 없다. 따라서 우리가 책을 발간하면 도서관에 의무 납부하는 것처럼 분리해서 괜챦은 미생물이다 싶으면 미생물은행에 기탁해야 한다. 내가 쓴 책이지만 공공의 자산이고 국가의 자산이다. 그런데 이것을 도서관에 맡겨 놓지 않으면 그 자산이 사라진다. 마찬가지로 분리한 미생물도 내 미생물이지만 크게 보면 국가의, 우리 나라의 미생물이다. 이 자산을 잃어버리기 전에 미생물 은행에 기탁해야 한다. 분리해서 쓸만하다 싶은 미생물은 미생물은행에 기탁해야 한다는 것이 연구자들의 기본 마인드로 자리를 잡아야 할 것이다.

미생물 보존에 대하여는 우리나라에서 보존연구까지는 바라지 않는다. 하지만 누군가는 미생물 보존에 대한 세부적인 지식을 가지고 있고 세계적인 동향을 파악하고 있어야 한다. 그래야 좋은 보존법이 개발되면 이를 국내에 적용할 수 있다.

이 번에 Sato 박사의 강의를 들어면서 외생균근 버섯의 보존에 버미큘라이트 보존이 좋다는 사실을 알게 되었다. 그러니 이를 곧 우리나라에도 도입해야 한다. 그리고 하나 더, 진공건조법에는 동결건조법과 액상건조법이 있는데 대부분의 국가들은 동결건조법을 사용하는데 일본의 NBRC는 액상건조법을 사용한다. 액상건조는 보존 처리 시간이 짧고 동결에 예민한 미생물의 보존도 가능하다. 따라서 동결건조의 액상건조로의 대체도 필요하다.

위에서 언급하였지만 우리나라에서 보존연구는 하지 않더라도 보존에 대하여 세계적인 흐름을 이해할 수 있는 보존전문가는 필요하다. 이 역할은 기본적으로 미생물은행에서 해야 한다. 한 기관에서만 하면 외롭고 발전이 어려울 것이니 농업미생물은행, 생물자원센터 두 기관 모두 필요하다. 그리고 실무업무는 테크니션이 할지라도 반드시 정규 연구원이 이 역할을 해줘야 한다. 그리고 부서장 또는 기관장은 미생물 보존이 특별히 성과가 나오지 않더라도 그 노고에 대하여 충분히 인정해 줘야 한다. 물론 산림과학원 또는 농촌진흥청의 버섯과 등의 미생물 자원을 실제 사용하는 부서에서도 보존 전문가가 있다면 더욱 좋겠다.

* Sato 박사의 발표자료는 ACM22 이후에 사용을 허가 받았으며 지식의 공유에 감사드립니다.

<참고 문헌>

국립농업과학원. 2022. 농업미생물은행(KACC) 업무편람. 214쪽.

농업환경기술연구소(일본). 1987. 미생물의 장기보존법. 농림수산기술회의사무국. 183쪽.

신명숙, 홍승범. 2014. 농업미생물은행(KACC)의 곰팡이 보존. 한국균학회지 42: 97-103.

한국식물병리학회. 1995. 식물병원 germplasm 장기보존. 한국식물병리학회. 87쪽.

Sato Masanori. 2024. Development of long-term preservation techniques for difficult-to-preserve basidiomycetes and appropriate management techniques during transport of animal cells. Microb. Resour. Syst. 40: 93-10.

Sato M, Inaba S, Noguchi M, Nakagiri A. 2020. Vermiculite as a culture substrate greatly improve the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes. Fungal Biolo. 124:742-751.

Smith D, Onions AHS. 1994. The Preservation and maintenance of living fungi. CAB International Wallingford. UK. 122 pp.

(2026. 1. 16. 곰박)