단백질 재조합 기술 2편
<선별하기(Screening)>
그런데 여기서 문제가 하나 생긴다. 대장균 안에 재조합된 플라스미드가 잘 들어가 있는지 어떻게 알 수 있단 말인가. 플라스미드가 잘 들어가 있는지 대장균에게 물어볼 수도 없는 노릇이다. 이때 재조합된 플라스미드가 잘 들어가있는지 확인하는 방법이 바로 Screening이다.
현재 단계까지 존재할 수 있는 대장균의 가능성은 3가지이다. 첫째, 형질전환이 일어나지 않아 대장균 안에 플라스미드가 없는 경우. 둘째, 형질전환은 일어났으나 타겟 유전자가 들어가지 않은 플라스미드 벡터가 들어간 경우. 셋째, 타겟 유전자가 들어간 재조합된 플라스미드로 형질전환된 경우이다. 우리에게 필요한 대장균은 마지막 경우의 대장균으로, 이 대장균만을 선별하기 위해 가장 많이 쓰이는 방법 중 하나인 Blue-White Screening을 소개하고자 한다.
Blue-White Screening를 위해 대장균을 선별을 위한 특수 배지*에서 키운다. 우선 이 특수 배지에는 항생제인 암피실린이 들어있다. E.coli DH5α는 암피실린 항생제 저항 유전자가 없고, 반대로 pUC 플라스미드에는 암피실린 항생제 저항 유전자가 있다(항생제 저항 유전자는 위에서 말한 플라스미드 벡터들의 편리한 기능 중 하나이다). 따라서 형질전환이 일어나지 않은 첫 번째 경우의 대장균은 이 배지에서 키울 경우 균을 죽이는 항생제에 의해 모두 죽게 된다.
*) 배지: 배지는 세균이나 세포를 배양하기 위한 영양소가 풍부한 물질이다. 흔히 매체에서 세균을 키울 때 쓰는 동그란 페트리 접시에 담긴 황토색의 고체가 가장 널리 쓰이는 배지 중 하나인 고체 배지이다.
반대로 형질전환되어 플라스미드가 있는 경우에는 항생제 저항 유전자가 있어서 항생제에서도 살아남을 수 있다. 두 번째 경우와 세 번째 경우의 구별을 위해 배지에 X-gal이라는 물질을 넣어 각 경우의 대장균의 콜로니(colony)* 색을 파란색 혹은 흰색으로 다르게 만든다(그래서 이 선별법의 이름이 Blue-White Screening이다).
*) 콜로니: 군체라고도 부른다. 대장균을 배지에서 키우면 대장균끼리 뭉치며 동그란 모양의 집락을 형성하는데, 이를 콜로니라 부른다.
pUC 플라스미드는 lacZ 유전자가 들어있는데, 단백질 재조합 기술을 활용할 때 lacZ 유전자 자리에 타겟 유전자를 삽입한다. lacZ 유전자에 암호화되어 있는 β-galactosidase 단백질은 X-gal을 분해하며, 분해된 후의 물질은 파란색을 띠게 된다. 따라서 두 번째 경우의 대장균의 타겟 유전자가 없으므로 lacZ가 남아있어 콜로니는 파란색을 띠는 반면, 세 번째 경우는 재조합된 플라스미드의 lacZ 유전자 서열이 바뀌면서 대장균 콜로니의 원래 색인 하얀색을 띤다. 따라서 흰색 대장균 콜로니에서 채취한 대장균에는 재조합된 플라스미드가 잘 들어있다고 확신할 수 있다.
[표지] Novagen ‘pET-28a-c(+) Vectors’
[그림1] DawinBio ‘Blue-white screen 원리’
Artist 'KIMSEUNG★' with Gallery MIND
